Implementación de un ensayo PCR multiplex para la identificación de las enterovariedades de Escherichia coli patógenas

Abstract

Escherichia coli patógenas son agentes causantes de enfermedades diarreicas en las personas, especialmente en niños de países en vía de desarrollo, poseen diferentes mecanismos de patogenicidad y se clasifican en E. coli Enterotoxigénica (ECET), E. coli Enteropatogénica (ECEP), E. coli Enteroinvasiva (ECEI), E. coli Enteroagregativa (ECEA), E. coli Enterohemorrágica (ECEH), y E. coli Entero difusa adherente (ECDA). En el Ecuador se ha reportado la identificación de ECEP, ECET, y ECEI mediante PCR individuales por lo que el objetivo de esta tesis fue implementar un ensayo PCR multiplex, con el fin de identificar cada Escherichia coli patógena, mediante un diseño de tipo exploratorio y confirmatorio. Primero, se obtuvo las cepas patógenas control positivo a las cuales se las analizó microbiológicamente y luego se aisló el ADN de cada una con un kit comercial, para proceder a diseñar la PCR. Inicialmente se optimizó las temperaturas de hibridación, se evaluó la concentración final de cada primer y los tiempos del termociclador para poder amplificar los genes vt1, vt2, eae, estA, eltB, aggR, ipaH y Da. Por el gran número de primers utilizados en esta técnica y para evitar interferencia entre cada uno, no fue posible diseñar una PCR multiplex, por lo que fue dividida en dos. Una amplificó las enterovariedades ECEH, ECEP, ECDA y la otra ECET, ECEI, ECEA. Para cada PCR implementada se realizó el límite de detección tomando como patógenos de referencia a ECEH para la primera PCR multiplex y ECET para la segunda, con un límite de detección de 0,0029 ng/µL y 0,011 ng/µL respectivamente. La técnica propuesta presentó una alta eficiencia, sensibilidad y especificidad en los controles positivos, otras cepas y muestras de heces, en un ensayo de campo limitado.