Diagnostico rápido de infección Quirurjica por biología molecular mediante un ensayo de amplio espectro PCR 16S RDNA

Abstract

Se desarrolló un sistema de diagnóstico molecular basado en las técnicas de PCR (Reacción en Cadena de Polimerasa) y RFLP, (Polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción) el cual permite una rápida detección e identificación de patógenos bacterianos presentes en muestras clínicas con sospecha de infección quirúrgica.

El ensayo de PCR amplifica un fragmento de 467 pb mediante un par de primers universales, los cuales hibridan en una región conservada del gen que codifica para el ARN ribosomal 16S. El producto de PCR es analizado mediante un ensayo RFLP utilizando las enzimas de restricción AccIII, Csp451, KpnI y HaeIII, que producen diferentes patrones de digestión para distintos grupos y géneros bacterianos.

El principal inconveniente del sistema es la generación de resultados falsos positivos debido a la amplificación de ADN contaminante presente en los reactivos utilizados en el ensayo y sintetizados a partir de fuentes bacterianas. Para descontaminar la PCR se evaluó un tratamiento con 8-MOP (8-methoxypsoralen, 25ug/mL) fotoactivado con luz UVC a 256nm. Se determinó que el tiempo de irradiación necesario para que el psoralen sea efectivo es de 3 minutos.

La sensibilidad analítica del sistema expuesto al tratamiento disminuyó 10 veces en comparación con el sistema sin 8-MOP., siendo el límite de detección de la PCR descontaminada 100 UFC/ml.

Para determinar la utilidad del ensayo, se procesaron 17 muestras clínicas recolectadas de pacientes con sospecha de infección quirúrgica. De ellas, siete se compararon con los respectivos resultados microbiológicos, manifestando una concordancia entre las técnicas del 86% para la PCR y 14% para RFLP. Los resultados sugieren que el ensayo es útil en la detección de infecciones quirúrgicas pero puede presentar limitaciones en la identificación del género bacteriano.