Marcaje fluorescente de la proteína de superficie GP63 de leishmania mexicana mediante CRISPR/CAS9

Abstract

La leishmaniasis es una enfermedad desatendida causada por cerca de 20 especies del género Leishmania, que afecta a un número considerable de personas en el Ecuador y en el mundo; siendo la proteína GP63 esencial para la infectividad del parásito. Por otro lado, la técnica CRISPR/Cas9 ha demostrado ser práctica en la edición genómica de Leishmania spp., tanto para marcaje de proteínas como para silenciamiento de genes. Por lo tanto, en el presente es- tudio se aplicó el sistema CRISPR/Cas9 para fusionar la proteína fluorescente mNeonGreen a GP63, con el fin de que en un futuro se pueda aprovechar su seguimiento en tiempo real. Se logró transfectar Leishmania mexicana con un plásmido que contenía Cas9 y resistencia a hi- gromicina, además de un ADN donador que, además de mNeonGreen, codificaba una enzima de resistencia a G418. Después de días de selección, se obtuvo una población resistente a G418 que sugiere que la transfección fue exitosa, aunque no fue posible observar fluorescencia a la longitud de onda característica de mNeonGreen; surgiendo, asimismo, incovenientes con posi- ble autoflorescencia. Este fenómeno pudo deberse a que la eficiencia de transfección fue baja y las técnicas de sondeo poco sensibles o que la Cas9 guiada por el ARNg tuvo un inconveniente encontrando la secuencia diana, por posibles rearreglos de la cromatina.