Estandarización del método de transfección de callo y suspensiones celulares de tabaco (nicotiana tabacum) mediante agrobacterium tumefaciens

Abstract

En la actualidad existen diferente método físicos o químicos para transfectar plantas, pero la mayoría presentan desventajas durante la inserción de genes de interés. La transfección mediada por A. tumefaciens es un método ampliamente empleado a nivel de laboratorio por su facilidad y costo. El tabaco (Nicotiana tabacum) ha sido ampliamente empleada para protocolos de transfección por su facilidad y eficiencia de transfección con Agrobacterium. Por ello, la presente investigación tuvo como objetivo estandarizar un protocolo de transfección de callo y suspensiones celulares de tabaco mediante A. tumefaciens. Para lo cual, se realizó la desinfección de explantes de hojas de N. tabacum de 3 meses de edad con 0.5 % (v/v) de NaClO durante 2 minutos. La inducción de callo tipo friable (100%) en los explantes desinfectados se logró con la adición de 2 mg/L de ANA y 0.2 mg/L de Kinetina en el medio MS. La transfección de los callos de tabaco mediante A. tumefaciens GV3101 (OD600nm=0.6) con el plásmido pSiM24-GUS con 20 minutos de inmersión y 3 días de cocultivo, permitió obtener callos con resistencia al marcador de selección Kanamicina (50 mg/L). No se observó la expresión del gen reportero GUS debido al necrosamiento que presentaron los callos. Las condiciones ideales para obtener un 100% de suspensiones celulares de tabaco con resistencia a la Kanamicina (50 mg/L) y expresión del gen reporte GFP, fueron la adición de 10mM de Acetosiringona en el medio de cocultivo y 3 días de cocultivo con A. tumefaciens LBA4404 (OD600nm=0.8) con el plásmido pSiM24-eGFP.