Adaptación del sistema CRISPR /Cas9 para edición genética en el microorganismo no modelo burkholderia sacchari

Abstract

El presente proyecto de investigación tiene como objetivo principal adaptar el sistema CRISPR/Cas9 para edición genética en el organismo no modelo Burkholderia sacchari. Esta bacteria Gram-negativa tiene el potencial de producir moléculas de alto valor a escala industrial a partir de fuentes de carbono renovables como: glucosa, sacarosa, xilosa y arabinosa. Adyacente a las secuencias de ADN denominadas CRISPR, se encuentran diferentes tipos de nucleasas. Las endonucleasas Cas9 se pueden programar con moléculas de ARN individuales para escindir zonas de ADN específicas. Se realizó un estudio cinético de la curva de crecimiento de este organismo y se logró determinar su tiempo de adaptación (3h-3.5h) y fase exponencial (3.5h hasta 8.5 h). Se utilizó el método de ensamblaje de Gibson para construir el plásmido de expresión de la endonucleasa Cas9, se realizó un diseño in silico de dicho plásmido y posteriormente se desarrollaron tres ensayos in vivo, obteniéndose resultados desfavorables, en consecuencia, no se logró adaptar el sistema CRISPR/Cas9 en B. sacchari por posibles problemas de hibridación entre los oligonucleótidos a causa de la formación de estructuras secundarias. Se recomienda realizar un análisis previo de las estructuras secundarias de los primers utilizados en un ensamble Gibson.