Evaluación de la técnica de secuenciación de alto rendimiento TASPERT (TArget-SPecific Reverse Transcript) en la detección de PVY (Potato Virus Y), TMV (Tobacco Mosaic Virus) y TBSV (Tomato Bushy Stunt Virus) en Solanum lycopersicum L

Abstract

La detección de patógenos virales ha evolucionado a lo largo del tiempo, desde de métodos empíricos hasta diagnósticos más avanzados como q-PCR y Secuenciación de Alto Rendimiento (HTS). En esta investigación, se evaluó la técnica de secuenciación de alto rendimiento TArget-SPecific Reverse Transcript (TASPERT) utilizando el dispositivo MinIon para detectar virus en plantas de tomate. Para ello, se cultivó e inoculó plantas de tomate con Potato Virus Y (PVY), Virus del mosaico del tabaco (TMV) y Tomato Bushy Stunt Virus (TBSV) de manera independiente y simultánea. Luego, se extrajo el ARN utilizando el kit de Qiagen y se utilizó agua libre de nucleasas como control negativo. Después, se seleccionaron las mejores muestras para la síntesis de ADNc utilizando diferentes tipos de primers diseñados para el protocolo de TASPERT, como primer Flap, Two Steps y primers de literatura. La preparación de librerías de ADNc se realizó con el kit Direct cDNA Native Barcoding (SQK-DCS109) para la secuenciación. Los datos generados fueron recopilados y clasificados utilizando el software minimap2. Se seleccionaron las plantas inoculadas que mostraban síntomas de infección viral para la extracción y secuenciación de ARN. Mediante la secuenciación con TASPERT, se logró detectar los virus inoculados con una cobertura de genoma superior al 95%, independientemente del tipo de cebador utilizado. Sin embargo, existió diferencias significativas en la abundancia relativa de las secuencias virales según el tipo de primer. El primer Flap mostró una mayor abundancia relativa para PVY, Two Steps para TMV, y no se encontraron diferencias en el caso de TBSV. Finalmente, se comparó el ADNc sintetizado con TASPERT con el ADNc sintetizado con el Gold Standard mediante q-PCR y este generó falsos positivos y negativos, además de tener valores de Ct más altos en comparación con los obtenidos con TASPERT. TASPERT superó al método Gold Standard en términos de detección y sensibilidad, lo que lo convierte en una herramienta prometedora para el diagnóstico de enfermedades virales en plantas.