Construcción de un vector plasmídico para la edición genética del promotor del gen RPM1 asociado a la resistencia de fusariosis en banano

Abstract

El banano (Musa spp.), perteneciente a la familia Musaceae, es un alimento básico para más de 400 millones de personas. Más del 40% de la producción mundial de bananos y el comercio de exportación se basa en la variedad Cavendish. Sin embargo, Cavendish está amenazado por Fusarium oxysporum f. sp. cubense tropical raza 4 (FocR4T), que es una cepa virulenta que invade las raíces y posteriormente coloniza y obstruye el sistema vascular, lo que conduce a la muerte de la planta. En ese sentido, el objetivo del presente trabajo es construir un vector plasmídico para la edición genética del promotor del gen RPM1, relacionado con resistencia a la fusariosis producida por FocR4T. La estrategia implementada se basa en el diseño in silico del vector plasmídico y el ensamblaje in vitro del plásmido mediante clonación modular (MoClo) basado en la técnica de Golden Gate. Mediante SnapGeneTM fue posible simular el ensamblaje de estas partes y predecir su funcionalidad. Posteriormente, se procedió al ensamblaje in vitro del vector plasmídico, a partir del uso de las enzimas BsaI y BbsI. Mediante esta metodología, fue posible obtener un vector plasmídico funcional que contenga el sgRNA, el promotor TaU3, nucleasa SpCas9 y un marcador de selección en plantas. La transformación en Escherichia coli evidenció una mayor eficiencia en la cepa JM109 en comparación a TOP10 y DH5a. La herramienta bioinformática CRISPOR facilitó el diseño de un ARN guía altamente específico, con una efectividad de al menos 97% y un máximo de 8 sitios secundarios predichos. Además, mediante pruebas de validación, como Colony PCR, fue posible validar con precisión el ensamblaje del vector. Estos hallazgos respaldan la viabilidad tanto del ensamblaje de plásmidos mediante Golden Gate, así como de la transformación en E. coli., además de que abren nuevas perspectivas con respecto a la investigación e implementación de la edición genética dirigida a la resistencia a enfermedades en cultivos de interés agronómico como el banano.