Desarrollo de un sistema de vector binario de Agrobacterium tumefaciens para la edición del promotor del gen RIN4 de banano

Abstract

En el campo de la Biotecnología vegetal, Agrobacterium tumefaciens es una herramienta potencial para transferir material genético de interés. Su importancia radica en la capacidad de producir mutaciones puntuales y específicas a partir de constructos presentes en su sistema de vector binario, el mismo que puede contener sistemas de edición genética como CRISPR-Cas que faciliten la mejora genética de plantas. El presente trabajo pretende transformar A. tumefaciens AGL1 con un plásmido capaz de editar el promotor del gen RIN4 asociado a la fusariosis en banano. Para ello se estableció condiciones específicas asociadas a los métodos de shock térmico y electroporación que incluyeron: preparación de células competentes, control de temperatura, selección del tamaño de la cubeta de electroporación, determinación de la cantidad de ADN y el tipo de medio de recuperación. Dada la importancia de este gen en la inmunidad innata de las plantas, fue necesaria la confirmación de su región promotora en el germoplasma del banano ecuatoriano, mediante técnicas moleculares. Asimismo, debido al tiempo y recursos que conlleva la estandarización de protocolos, definir condiciones de almacenamiento de células a largo plazo es fundamental, lo que impulsó la evaluación de diferentes concentraciones de glicerol y DMSO como agentes crioconservantes de A. tumefaciens transformadas. Los resultados obtenidos mostraron que los protocolos aplicados mejoraron la eficiencia de transformación, y que la edición es posible debido a la presencia de este gen de resistencia en el genoma de las variedades de banano tipo Cavendish. Además, tanto el glicerol como el DMSO pueden usarse eficazmente como agentes conservantes en concentraciones de 20 a 30% y 10%, respectivamente.